[На главную] [К оглавлению тома]

Техника микроскопического исследования органа слуха человека

Н.Ф. Попов
(Москва)

Техника микроскопического исследования органа слуха человека требует много времени, усидчивого труда, много терпения, большой силы характера и необыкновенной настойчивости.

На каждом шагу при микроскопическом исследовании органа слуха можно, без всяких видимых причин, потерпеть неудачу, доводящую работающего до отчаяния, в особенности при потере очень ценного гистологического материала, который готовился многие и многие месяцы.

Вот почему многие гистологи нередко обходили этот весьма важный и необыкновенно интересный орган чувства. Затруднения заключаются, главным образом, в недоступности ушного лабиринта, нежные и высоко диференцированные клеточные элементы которого заключены в очень толстой, весьма твердой и хрупкой костной капсуле височной пирамиды. Но благодаря прогрессирующему совершенствованию методов микроскопического исследования, в настоящее время удается пирамиду височной кости человека микротомной бритвой разложить на серию микроскопических разрезов с сохранением топографических соотношений всех мельчайших структурных элементов пирамиды.

Таким образом, мы можем проникнуть в детали строения перепончатого лабиринта и познакомиться ad oculos с весьма сложными и очень важными аппаратами органа слуха. Вот почему в последнее время явилась возможность подойти к исследованию тех многих патологических процессов, результатом которых бывает нарушение функции уха.

Этот путь, наряду с другими, открывает нам возможность изучать патогенез тех ушных заболеваний, которые доводят многих больных до полной и неизлечимой глухоты.

Чтобы произвести микроскопическое исследование органа слуха, не нарушив топографических соотношений и морфологических особенностей структурных элементов перепончатого лабиринта, необходимо височную кость зафиксировать.

При фиксации, как известно, клеточные элементы переводятся в соединения, нерастворимые в воде в том состоянии, в каком фиксирующая жидкость застала ту или другую клетку в данный момент. Фиксация должна считаться тем идеальнее, чем меньшие изменения объема и формы при этом претерпевают клетки и ткани.

Ткани и клетки, составляющие орган слуха, весьма разнообразны, и нет ни одного вида ткани, который бы не участвовал в построении органа слуха. Неодинаковые по своим химическим и физическим свойствам, весьма разнообразно построенные ткани, собранные в органе слуха на одном небольшом пространстве, при фиксации должны подвергнуться действию одного и того же реагента.

Прежде чем подвергнуть височную кость действию фиксирующей жидкости, можно было бы костную капсулу органа слуха расчленить для непосредственного соприкосновения этой жидкости с мягкими частями лабиринта. Сделать это, не повредив их, не удается, так как в лабиринте в системе каналов и полостей с жидкостью и с твердыми костными стенками помещается система таких же полостей и также наполненная жидкостью, но ограниченная нежными, мягкими перепончатыми стенками. Обе эти системы полостей находятся в определенном механическом соотношении. При удалении костной капсулы изливается перилимфа, а при нарушении целости перепончатого лабиринта изливается эндолимфа, что неминуемо приводит к изменению топографических соотношений структурных элементов внутреннего уха.

Для идеальной фиксации органа слуха необходимо, чтобы фиксирующая жидкость пришла в быстрое и непосредственное соприкосновение с перепончатым лабиринтом. Но, как известно, самые лучшие фиксирующие жидкости не скоро и недостаточно могут проникнуть через костную лабиринтную капсулу.

Как чувствующие клетки, так и поддерживающие элементы концевых аппаратов внутреннего уха после смерти организма очень скоро изменяются в силу своей особенно высокой степени неустойчивости, едва ли отмеченной в каких-нибудь клетках других органов.

Вследствие этого фиксирующие жидкости, подействовавшие на эти клетки, с развившимися посмертными изменениями, сморщивали бы их или зафиксировали бы их разбухшими, что представило бы собой искажение прижизненных форм клеточных элементов органа слуха.

Нейтральные фиксирующие вещества проникают через кость очень медленно, а фиксирующие жидкости, содержащие кислоту, хотя проникают лучше, но на своем пути к перепончатому лабиринту, проходя через костную капсулу с ее известковыми солями, нейтрализуются и теряют свое действие. При этом от кислоты, вследствие химической реакции, могут образоваться на костных частях пузырьки газа и вызвать разрывы нежных тканей, тонких перепонок, а также изменить положение слабо укрепленных частей перепончатого лабиринта.

Для удачного микроскопического исследования органа слуха из множества предложенных самых разнообразных по составу жидкостей выбирают такую, которая сохранила бы, по возможности, как топографические отношения между клетками и тканями, так и все их морфологические свойства в том состоянии, в каком они были при жизни.

Применение этой фиксирующей жидкости должно быть просто, без всяких сложных манипуляций, которые часто могут быть причиной неудачи всей работы.

Трудно найти такую идеальную жидкость, которая могла бы одновременно хорошо зафиксировать все различные клеточные и тканевые части органа слуха. Эпителий, соединительная ткань и нервы по своим физическим и химическим свойствам не могут одинаково относиться к одному и тому же фиксирующему реагенту.

Вот почему, наряду с хорошо зафиксированными волосатыми и Дейтерсовыми клетками, трудно одновременно получить хорошо зафиксированные и нервные волокна. Для фиксации органа слуха мы применяли жидкости с осмиевой кислотой, как то: Флемминговскую, Германовскую и комбинацию их по Katz'y.

Недостаток этих жидкостей приходилось наблюдать в том, что они не проникали глубоко в ткани, легко оставляли осадки и известью костной лабиринтной капсулы нейтрализовалась содержавшаяся в них осмиева кислота. В тех же случаях, когда им облегчался доступ к перепончатому лабиринту через отверстия, сделанные в костной капсуле, эти жидкости все-таки не проявляли должного действия, и только те части перепончатого лабиринта удовлетворительно фиксировались, которые непосредственно соприкасались с этими жидкостями.

Пользовались мы также фиксирующими жидкостями с концентрированным раствором сулемы и в комбинациях с осмиевой, уксусной и пикриновой кислотами, а также с Мюллеровой жидкостью. Все эти жидкости также медленно проникали во внутреннее ухо, и поэтому мы должны были часто возобновлять их и применять в больших количествах. При этом получались обильные осадки сулемы, которая очень медленно растворялась при помощи t-ra jodi.

Сравнительно недавно многие авторы для фиксации органа слуха стали применять жидкость в следующей, особенно удачной, комбинации: Formol + Kalium bichromicum + Acidum aceticum glaciale.

Такой фиксирующей жидкостью пользовались также современные гистологи, как, например, Held и Kolmer, при своих обширных гистологических исследованиях тончайшего строения органа слуха млекопитающих. Wittmaack, Joschii и после них многие другие отологи при своих экспериментальных исследованиях органа слуха применяли такую же фиксирующую жидкость, но в различных соотношениях ингредиентов.

При фиксации этой жидкостью как все чувствующие элементы концевых аппаратов, так и элементы, их поддерживающие, и вообще весь нервный аппарат внутреннего уха, по уверению гистологов, особенно хорошо сохраняются. При этом выявляется диференцировка протоплазматических и ядерных деталей, что, вероятно, обусловливается содержанием в них хрома. Формалин в такой смеси лишается своих неприятных для фиксации коагуляционных свойств. Под влиянием уксусной кислоты в этой жидкости образуется хромовая кислота, которая, как известно, больше и глубже проникает и фиксирует, чем Kalium chromicum. Вообще при фиксации в этой смеси, вероятно, происходят процессы окисления.

Held пользовался этой жидкостью в таком составе: Kalium bichromicum 3% + Formalin 4% + Acidum aceticum glac. 5%, и применял ее для фиксации только после того, как она некоторое время постояла и делалась темнозеленой, т.е. он не готовил ее ex tempore, как это делали Wittmaack и другие. В термостате (37°С) эта жидкость темнеет от образования хрома.

Прежде чем приступать к гистологическому исследованию органа слуха, необходимо владеть хотя бы обычной техникой микроскопического исследования.1

В кратком изложении гистологической техники органа слуха человека мы будем касаться ее постольку, поскольку это будет относиться к особенностям височной кости человека. Прежде чем выделить височную кость из черепа, необходимо приготовить сосуд с фиксирующей жидкостью, в которую должна быть положена височная кость.

Как выделять височные кости из черепа человека, изложено в следующей главе "Секционная техника органа слуха".

Конечно, первое и самое главное условие успеха микроскопического исследования состоит в том, чтобы височные кости взять из трупа, по возможности свежего, т.е. как можно скорее после смерти. Этим предупреждаются посмертные явления, так как часа через два наступают уже изменения в чувствующих клетках внутреннего уха (по Alexander'y, крайний срок - 7 часов после смерти).

При выделении височных костей для микроскопического исследования не рекомендуется пользоваться долотом и молотком. Необходимо выделять эти части как можно скорее, без толчков и сотрясений, непосредственно за удалением головного мозга. Этим предохраняют от высыхания височные кости с их liquor labyrinthi, которая может теряться, и с нервным пучком (n-vus VIII), на который неблагоприятно действуют как высыхание, так и простая вода.

Выделенные таким образом височные кости целиком, без уменьшения, т.е. без всякого отпиливания и сдалбливания, помещаются непосредственно в банку с большим количеством фиксирующей жидкости. При этом банку выбирают широкогорлую с притертой пробкой, размеров, соответствующих количеству жидкости, которое должно равняться 20 объемам фиксируемого объекта. Фиксирующую жидкость мы готовим ex tempore, непосредственно перед секцией, по такому рецепту: Sol. Kalii bichromici 10% 30,0, Aquae destillatae 60,0, Formalini, Acidi acetici glacialis aa 5,0. M. D. S. Для фиксации.

Объект, находясь в фиксирующей жидкости, не должен прилегать к какой-нибудь стенке сосуда, а со всех сторон должен быть окружен слоем фиксирующей жидкости одинаковой толщины. Для этого объект подвешивается на нитке и прикрепляется к стеклянному крючку, находящемуся на нижней поверхности стеклянной пробки. Возможно иногда подвесить такой объект или в стеклянном решете, или в стеклянном кольце, обтянутом марлёю.

Банка с височными костями в фиксирующей жидкости помещается в термостате при температуре в 37°С для ускорения физико-химических реакций при фиксации. Нередко артефакты происходят от медленного проникновения жидкости. Ввиду этого необходимо следить, чтобы не было пузырьков воздуха в объекте, потому что они препятствуют проникновению жидкости.

Удачная фиксация предохраняет височные кости от последующих артефактов вследствие дакальцинации. Если объект недофиксирован, то при декальцинации происходят сморщивания клеток и нежных тканей. После продолжительных фиксаций объекты плохо красятся. Alexander утверждает, что если в течение 24-48 часов фиксирующая жидкость не достигнет нейроэпителия внутреннего уха, то он мацерируется. Височные кости, с соблюдением вышеуказанных условий, мы фиксируем две недели, причем жидкость несколько раз меняем. Вначале через день, потом через три дня и, наконец, через пять дней.

Некоторые авторы применяют фиксацию височных костей через сосуды (т.е. у животных - прижизненную). После промывки кровеносных сосудов через carotis физиологической жидкостью Ringer'a, непосредственно вливают в них фиксирующую жидкость, потом выделяют височные кости и помещают их в такую же фиксирующую жидкость.

Этот метод очень капризный, на человеке он не применим.

При консультации нам много раз приходилось видеть микроскопические препараты после такой прижизненной фиксации через вливание, и всякий раз мы находили препараты неудачными, т.е. ценный экспериментальный материал испорченным.

Многие гистологи воздерживаются от такого способа фиксации. После фиксации височные кости подвергаются декальцинации - из них удаляются известковые соли. Декальцинация не должна происходить с бурной реакцией, чтобы не было разрывов тонких перепонок, чтобы не произошло смещения клеток и других структурных элементов. Декальцинация не должна вызывать набухания тканей и не должна влиять неблагоприятно на способность элементов краситься. Самой лучшей декальцинирующей жидкостью для височной кости человека должно признать 5% водный раствор чистой, крепкой азотной кислоты. Manasse применяет 10% раствор ее в течение 4-6 недель; Alexander 5% - в течение 4 недель. Мы применяем 5% (по объему) водный раствор чистой, крепкой азотной кислоты в количестве, равном 10 объемам объекта.

Из фиксирующей жидкости мы перекладываем височную кость без промывки, осторожно, без толчков в сосуд с только что упомянутой декальцинирующей жидкостью, которая должна окружать объект со всех сторон слоем одинаковой толщины.

Первые 10 дней декальцинирующая жидкость возобновляется ежедневно, вторые 10 дней - через два дня и следующие 10 дней - через три дня. Объект все время должен находиться в действующем кислотном растворе, потому что в слабом кислотном не действующем растворе происходит набухание тканей. Продолжительная декальцинация может вызвать также набухание тканей.

Следовательно, мы декальцинируем височную кость человека в 5% азотной кислоте около месяца. Степень декальцинации контролируем уколом хорошо полированной острой иглы в полукружные каналы, в стенки meatus acusticus internus и в участок между преддверием и улиткой.

После декальцинации из височных костей удаляются остатки азотной кислоты, чтобы не произошло набухания коллагенных тканей от кислоты в сильном ее разведении.

Перед промыванием височных костей в текучей воде мы удаляем остатки кислоты химическим путем, помещая наши объекты в 5% водный раствор Natrii sulfurici, или Lithii sulfurici, или в такой же раствор калийных квасцов на 24 - 48 часов, возобновив один раз жидкость.

Теперь можно уменьшить височную кость, срезав бритвой или острым ножом чешую, верхушку пирамиды, сосцевидный отросток и вообще удалив все те части, которые не подлежат исследованию.

В конце - концов, получается блок в форме кубика, заключающий в себе среднее и внутреннее ухо. При этом можно срезать верхушку верхнего полукружного канала для лучшего проникания Celloidin'a. Далее следует промывка височной кости под краном, в медленно текучей воде, в течение 24-48 часов.

После декальцинации, ощелачивания и промывки наши объекты должны подвергнуться -последовательному уплотнению и обезвоживанию (хотя и фиксация отчасти уплотняет их). Последовательное уплотнение дает объектам консистенцию, необходимую для получения на микротоме микроскопических срезов. При этом должно стремиться к тому, чтобы объекты были вполне обезвожены, тогда только удается хорошо их заделать в Celloidin и удачно микротомировать. Незначительные остатки воды мешают проникнуть Celloidin'y, отчего объект плохо режется на микротоме. После промывки височные кости осторожно перекладывают в банку с 70% алкоголем, через три дня- в банку с 80% алкоголем, спустя три дня - в № 1- 95% алкоголь и через два дня - в № 2-95% алкоголь. Далее следует обезвоживание в абсолютном алкоголе - в № 1 два дня и в № 2 - также два дня. Потом объекты перекладывают в смесь равных объемов абсолютного алкоголя и безводного серного эфира. Здесь объекты находятся один день, после чего их перекладывают в новую порцию этой смеси.

Итак, объекты обезвожены, и можно приступить к пропитыванию их раствором Celloidin'a.

Предварительно готовят три раствора Celloidin'a.

Celloidin в продаже представляет собою влажную плитку (40,0), заключенную герметически в жестяную коробку. По вскрытии коробки плитку разрезают на маленькие кубики, приблизительно около 0,5 см, и оставляют на листе белой чистой бумаги на сутки на воздухе, при этом от пыли накрывают другим таким же листом бумаги. После этого сухой Celloidin в кубиках помещается в банку с притертой пробкой и в таком виде сохраняется.

Из этого сухого Celloidin'a готовят три раствора различной консистенции: 2%, 4% и 8% в соответственных количествах смеси в равных объемах абсолютного алкоголя и безводного серного эфира. Наши блоки (пирамиды височных костей) из № 2 смеси алкоголя с эфиром переносятся в Celloidin № 1, т.е. в 2% раствор, и остаются здесь для пропитывания не менее одного месяца.

Объект в Celloidin'e должен быть в банке с хорошо пришлифованной пробкой, чтобы не происходило сгущения раствора. Через месяц и более эти блоки перекладывают в такую же банку с 4% раствором Celloidin'a, и здесь объекты остаются также месяц. Наконец, по истечении этого срока их переносят на неделю в 8% раствор Celloidin'a.

Чтобы заделать наш блок в Celloidin, мы предварительно делаем из толстой бумаги коробочку, соответствующую размерам объекта, но лучше больших размеров; потом парафинируем ее, окунув в расплавленный парафин. Потом на дно коробочки выливаем слой 8% Celloidin'a, переносим в него объект, укладываем его в том положении, в котором намереваемся резать, и заливаем этим же 8% Celloidin'ом, наливая его в уровень с краями коробки. После того, как в коробочке сверху образовалась плотная пленка от высыхания Celloidin'a на воздухе, мы переносим ее в пары хлороформа (в хлороформную баню). Для этого берут обыкновенный эксикатор с хорошо пришлифованной крышкой, на дно его наливают около 30,0 хлороформа и в пары его помещают на подставке объект в коробочке с Celloidin'ом. Через сутки Celloidin в коробочке затвердевает (для большего затвердения лучше оставить объект еще на несколько дней в парах хлороформа). Потом снимается размякшая бумажная коробочка, и объект помещается в 70% алкоголь, где он может сохраняться продолжительное время.

Когда celloidin'овый блок с объектом окончательно затвердел, его наклеивают на деревяшку (деревянный кубик). Берут соответственной величины деревяшку (предварительно ее нужно подержать в крепком алкоголе для удаления смолы) и на одну (ровную) из ее поверхностей наносят тонкий слой 8% Celloidin'a, на который объект соответственной стороной накладывают и осторожно прижимают; при этом полезно облить объект сверху Celloidin'ом и оставить на воздухе подсохнуть, а потом перенести в пары хлороформа и на следующий день, вместе с деревяшкой, поместить блок в банку с 70% алкоголем; после этого объект можно микротомировать.

Чтобы изучить точную локализацию патологического процесса и проследить его распространение в концевых аппаратах внутреннего уха и в особенности в улитке, да и вообще во всей височной кости, необходимо при микротомировании из объекта получить беспрерывные серии срезов.

Техника удачного микротомирования (от нее зависит и сама техника получения срезов) подробно описана в указанных выше руководствах по микроскопической технике. В каком направлении микротомировать данную пирамиду височной кости, зависит от задач и целей исследования.

Способ разрезывания пирамидки вдоль оси, перпендикулярно плоскости верхнего полукружного канала и по оси улитки имеет свои преимущества.

Разрезы перпендикулярно оси пирамидки, но параллельно оси улитки также поучительны. Для человеческой височной кости достаточны срезы в 20-30 микрон; конечно, лучше было бы получить срезы, толщиною в 10-15 микрон. Для получения серии микроскопических срезов органа слуха человека мы предпочитаем способ Даркшевича, который состоит в перекладывании срезов полированными кусочками фильтровальной бумаги и в сохранении этих срезов (в столбиках, перевязанных ниткою) в 70% алкоголе.

Когда весь блок изрезан, можно приступить к окраске срезов; методика окраски также подробно изложена в соответственных руководствах.

Мы окрашиваем каждый первый срез серии (т.е. после каждых последующих трех срезов) гематоксилином Эрлиха и эозином, чтобы получить ориентировочный препарат. Каждый второй срез окрашивается по van -Gieson'y. Третий срез окрашивается крезил-виолетом для выявления изменений в ганглиозных нервных клетках. В каждом четвертом срезе мы стараемся окрасить нервные волокна по Weigert'y.

Срезы, окрашенные крезил-виолетом, после обезвоживания, мы просветляем Cajeput'овым маслом. При всех других окрасках просветление срезов производится Kreosot'ом. После этого все срезы переносятся в Xylolum и, наконец, заделываются в канадский бальзам.

Относительно специальных окрасок и обработок при научно-исследовательских работах можно найти указания в соответственных руководствах и в специальной литературе как советской, так и иностранной.


1 Для справок можно указать всем известные руководства по гистологической технике: 1. А.В. Немилов - Курс практической гистологии. 1923 г. 2. Ф. Штёр - Учебник микроскопической анатомии человека (с техникой) 1901 - 1917 гг. 3. С.П. Шуенинов -Техника патолого-гистологического исследования. 1916 г. 4. М.Н. Никифоров - Микроскопическая техника. 1919 г.

[к оглавлению]